核磁共振波谱法及其应用系统解析 | 核磁共振专题（三）

目录

• 背景

• 原理

• 概述

• 相关谱

• 固体核磁波谱

• 核磁谱在蛋白质研究上的应用

• 核磁共振成像技术

1背景

第二次世界大战的爆发中断了对核磁共振的研究工作，但战后的几年中对于该领域的研究却取得了突破性的进展。在美国，两组物理学家分别开始开发一种更简单的办法用于观察在液体和固体中分子的原子核的核磁共振现象，取代了Rabi的在真空状态下的观察核磁共振现象的实验。在哈佛大学有Edward Purcell领导的包括了Henry Torrey和Robert Pound的小组。在斯坦佛大学有由Felix Bloch领导的包括了Wiiliam Hansen和Martin Packard的团队。

Edward Purcell

Felix Bloch

图解：1945年，两个独立的研究小组——一个由哈佛大学的Edward Purcell领导，另一个由斯坦佛大学的Felix Bloch领导——检测到在浓缩物质中的核磁共振现象。1952年，Bloch和Purcell因为他们具有划时代意义的实验而共享诺贝尔物理奖。

2原理

核磁共振波谱分析法(NMR)是分析分子内各官能团如何连接的确切结构的强有力的工具。 磁场中所处的不同能量状态（磁能级）。原子核由质子、中子组成，它们也具有自旋现象。描述核自旋运动特性的是核自旋量子数I。不同的核在一个外加的高场强的静磁场（现代NMR仪器由充电的螺旋超导体产生）中将分裂成2I＋1个核自旋能级（核磁能级），其能量间隔为ΔE。对于指定的核素再施加一频率为ν的属于射频区的无线电短波，其辐射能量hν恰好与该核的磁能级间隔ΔE相等时，核体系将吸收辐射而产生能级跃迁，这就是核磁共振现象。

大多数原子核都围着某个自身轴作旋转运动，因此，其本身所带正电荷就会形成环形电流，从而产生一种核磁矩。当以电磁波照射置于磁场中的这种原子核，则会发生某种频率能量的吸收。吸收后原子核能量发生变化，并发出核磁共振信号，这就是核磁共振现象。

NMR谱仪就像高级的外差式收音机一样可接收到被测核的共振频率与其相应强度的信号，并绘制成以共振峰频率位置为横坐标，以峰的相对强度为纵坐标的NMR图谱。

3概述

核磁共振频谱（Nuclear magnetic resonance spectroscopy，简称NMR spectroscopy），又称核磁共振波谱，是将核磁共振现象应用于测定分子结构的一种谱学技术。

NMR波谱仪按磁体可以分为永久磁体、电磁体和超导磁体。按射频频率(1H核的共振频率)可分为60，80，90，100，200，300，400MHz……等。按射频源又可分为连续波波谱仪(CW-NMR)和脉冲博里叶变换波谱仪(PFT-NMR)。

目前，核磁共振波谱的研究主要集中在H（氢谱）和C（碳谱）两类原子核的波谱。人们可以从核磁共振波谱上获取很多信息，正如同红外光谱一样，核磁共振波谱也可以提供分子中化学官能团的数目和种类，但除此之外，它还可以提供许多红外光谱无法提供的信息。核磁共振波谱对自然科学研究有着深远的影响，人们不仅可以借助它来研究反应机理，还可以用来研究蛋白质和核酸的结构与功能。供研究的核磁样品可为液体或固体。 　

磁性原子核，比如H和C在恒定磁场中，只和特定频率的射频场作用。共振频率，原子核吸收的能量以及信号强度与磁场强度成正比。比方说，在场强为21特斯拉的磁场中，质子的共振频率为900MHz。尽管其他磁性核在此场强下拥有不同的共振频率，但人们通常把21特斯拉和900MHz频率进行直接对应。

化学位移

在一个分子中，各个质子的化学环境有所不同，或多或少的受到周边原子或原子团的屏蔽效应的影响，因此它们的共振频率也不同，从而导致在核磁共振波谱上，各个质子的吸收峰出现在不同的位置上。但这种差异并不大，难以精确测量其绝对值，因此人们将化学位移设成一个无量纲的相对值，即：某一物质吸收峰的频率与标准质子吸收峰频率之间的差异称为该物质的化学位移，常用符号 "δ" 表示，单位为 ppm。而在实际应用中，四甲基硅烷常被作为参照物。

透过不同质子的化学位移，人们可以得出这些质子所处的化学环境，从而得出该分子的结构信息，这种过程称之为“解谱”。比如对于乙醇分子，具有三种不同化学环境的质子，即：甲基、亚甲基和羟基。在其H谱图上，可以看到3个特有的峰信号各自处于特定的化学位移，其中位于1 ppm的峰信号对应甲基，位于4 ppm的信号对应亚甲基，位于2~3 ppm之间的信号对应羟基，其具体化学位移值和采用的NMR溶剂有关。另外，从峰信号的强度可以得出相对应的质子数量，比如乙醇分子中的甲基拥有3个质子，亚甲基拥有2个质子，在谱图上，对应的甲基和亚甲基峰强度比为3：2。

现代的分析软件可以协助人们通过分析峰信号，从而得出究竟有几个质子形成了此信号。这种方法称作“积分”，即通过计算面积（不单单是高度，还有峰宽度）来得出相关质子数目。但必须指出的是，这种计算方法仅适用于最简单的一维谱，对于更复杂的谱图，比如C谱，其积分还与原子核的弛豫速率和偶极耦合常数相关，而这些常常被人误解。因此，用积分法来解析复杂核磁谱图是相当困难的。

耦合

峰的裂分 强度比

单重 1

双重 1:1

三重 1:2:1

四重 1:3:3:1

五重 1:4:6:4:1

六重 1:5:10:10:5:1

七重 1:6:15:20:15:6:1

在一维谱图上，除峰信号数量，峰信号强度之外，还有一个有助于解析分子结构的信息，即磁性原子核之间的J-耦合。这种耦合来源于临近磁性原子核的不同自旋状态数的相互作用，这种相互作用会改变原子核自旋在外磁场中进动的能级分布状况，造成能级的裂分，进而造成NMR谱图中的信号峰形状发生劈裂，信号峰的劈裂状态可以得出分子内各原子和官能团之间的连接方式，以及临近的磁性核数目。

两个相邻的氢核之间的耦合遵循一定的规则，n个氢核将把相邻磁性核信号峰劈裂成n+1个多重峰，并且这n+1个多重峰之间的强度关系依照杨辉三角形规则。例如，乙醇分子中的甲基峰与相邻的亚甲基耦合，呈三重峰状，三重峰之间的强度比为1：2：1。不过如果一个氢核同时与两个不同性质的氢核进行耦合，则不会得到三重峰，而是得到双双重峰（dd）。要注意的是，如果两个磁性核之间相隔3个化学键以上，耦合就变得十分微弱，以至于不会出现峰的劈裂，但在芳烃和脂环类化合物中三键距离以上的长程耦合通常可以得到较复杂的劈裂峰。

19F与31P通常由于其拥有更大的自旋量子数而显得不同，其余类似，比如氢核与氘核（2D）之间的耦合将把信号峰劈裂为1：1：1。

二级耦合

上文提到的内容是在耦合常数和化学位移间隔相比很小的情况下描述的，如果耦合常数较高，或化学位移间隔小，那么多重峰的情况将变得复杂，特别是两个以上的磁性核进行耦合时，这可以通过增强多重峰当中的特定几个峰，并以牺牲其他峰的代价进行解决，不过在高场谱（比如高频谱）当中，这种现象并不明显，因此提高核磁仪器的频率可以避免此问题。

磁不等价

在芳烃化合物和非弹性分子（比如烯烃）中，常会遇到由于各质子的磁不等价性而带来谱图复杂性增加，这需要计算化模型来辅助分析。

4相关谱

相关谱（Correlation Spectroscopy）是二维核磁波谱的一种，常常简写为COSY。其它二维谱还包括J频谱（J-spectroscopy），交换频谱（EXSY，Exchange spectroscopy），核欧佛豪瑟效应频谱（NOESY，Nuclear Overhauser effect spectroscopy），全相关谱（TOCSY，total correlation spectroscopy），近程碳氢相关（HSQC，Heteronuclear single quantum coherence），远程碳氢相关（HMBC，Heteronuclear multiple bond coherence）等。二维谱在解析分子结构方面可比一维谱提供更多的信息，特别是用一维谱解析复杂分子结构遇到困难的时候，二维谱可以提供帮助。历史上首次二维谱实验方法由比利时布鲁塞尔自由大学（Université Libre de Bruxelles）教授让·吉纳（Jean Jeener）于1971年提出，之后其实验操作由沃尔特·欧（Walter P. Aue），恩里克·巴尔托尔蒂（Enrico Bartholdi）和理查德·恩斯特（Richard R. Ernst）完成，并于1976年发表。

5固体核磁波谱

液体核磁样品如果放在某些特定的物理环境下，是无法进行研究的，而其它原子级别的光谱技术对此也无能为力。但在固体中，像晶体，微晶粉末，胶质这样的，偶极耦合和化学位移的磁各向异性将在核自旋系统占据主导，在这种情况下如果使用传统的液态核磁技术，谱图上的峰将大大增宽，不利于研究。

目前已经有一系列的高分辨率固体核磁技术被研发出来。高分辨固体核磁技术包含两个重要概念，即通过高速旋转来限制分子自取向和消除磁各向异性，对于后者，最常用的旋转方式是魔角旋转（Magic angle spinning），即旋转轴和主磁场的夹角为54.7°。

固体核磁技术常被用于膜蛋白，蛋白纤维和聚合物的结构探究，以及无机化学中的化学分析。但同样可被应用于研究于树叶和燃油。

6核磁谱在蛋白质研究上的应用

利用核磁谱研究蛋白质，已经成为结构生物学领域的一项重要技术手段。X射线单晶衍射和核磁都可获得高分辨率的蛋白质三维结构，不过核磁常局限于35kDa以下的小分子蛋白，尽管随着技术的进步，稍大的蛋白质结构也可以被核磁解析出来。另外，获得本质上非结构化（Intrinsically Unstructured）的蛋白质的高分辨率信息，通常只有核磁能够做到。

蛋白质分子量大，结构复杂，一维核磁谱常显得重叠拥挤而无法进行解析，使用二维，三维甚至四维核磁谱，并采用13C和15N标记可以简化解析过程。另外，NOESY是最重要的蛋白质结构解析方法之一，人们通过NOESY获得蛋白质分子内官能团间距，之后通过电脑模拟得到分子的三维结构。

7核磁共振成像技术

使核磁共振成像技术成为现实的一个决定性因素是处理大量而复杂的成像计算所必需的高速计算机。除了必要的计算能力外，还有其它三个领域的研究成果也为核磁共振成像技术的诞生奠定了基础。第一项技术是英国电子工程师Godfrey Hounsfield的研究成果。他在1971年制造了一种将X光机和电脑结合起来的仪器，并利用某些代数复制的原理从多个角度对人体进行扫描，从而创造出一种内部结构的剖面图效果。实际上，Hounsfield并不知道，南非的核物理学家Allan Cormack原本在1957年就公开发表了同样的设想，他使用的是一种被称为Radon转换的复制技术。虽然Cormack的研究成果并未得到广泛的传播，但1979年他仍然由于在计算机化X射线断面成像(CT)技术领域的杰出贡献而同Hounsfield共享了诺贝尔医学奖。CT技术的基本原理是很多在今天使用的成熟成像方法的基础。

对核磁共振成像至关重要的另两项研究成果同核磁共振相关。其中一项是将核磁共振技术作为医学检测工具的概念化；另一个是从核磁共振数据中获得有效图像的可行方法的发明。早在1959年，位于Berkeley的加州大学的J.R.Singer就曾建议，核磁共振技术可以被用作医学方面的检测工具。几年后，Baylor医学院的Carlton Hazlewood公布了使用核磁共振技术检查病人的肌肉疾病的研究成果。然后在1969年，在纽约布鲁克林区Downstate医学中心工作的物理学家Raymond Damadian开始设法使用核磁共振技术来探查人体内部的癌症早期的征兆。在1970年的一次实验中，他利用外科手术切除了在实验室老鼠身上移植的快速生长的肿瘤，并证明肿瘤的核磁共振信号同其它正常组织的信号是不同的。Damadian在1971年的《科学日报》上公布了这项实验的结果。但是至今，Damadian的方法不能证明在临床检测癌症方面是可靠的。 而让根据人体活性组织产生的核磁共振信号制成有效的图像成为可能的关键技术进步要归功于在70年代初期领导位于匹兹堡的核磁共振专营公司的化学家Paul Lauterbur。1971年，他看到化学家Leon Saryan重复Damadian对老鼠身上的肿瘤和健康组织进行的实验。Lauterbur得出结论，认为这项技术不能为检查肿瘤提供足够的信息，因此他继续对该技术进行改进，以获得一种使用核磁共振技术制图的有效方法。

技术的关键在于能够对样品中发出的核磁共振信号进行精确的定位：如果每个信号的位置都能被测定，样品的整体图像就可以制作出来。Lauterbur的破天荒的创意是在空间上统一的静力磁场上添加一个较弱的磁场，这个磁场用一种控制方法使其在位置上不与第一个磁场重叠，这样便创造出一种磁场强度上的差异。在样品的一端，叠加的磁场强度会很强，而在另一端由于精确的校准，磁场强度会趋向于变弱。因为在外部磁场中的原子核的振荡频率同磁场强度成正比，不同位置的样品会以不同的频率振荡。这样，可以根据不同的位置得出一个不同的共振频率。而且，各频段共振信号的强度可以根据样品中包含的以不同频率共振和处于不同位置的原子核显示出相应样品中的具体信息。在信号上的细微差别可以用来为分子的位置进行定位，从而制出相应的图像。(今天的核磁共振成像设备在被检测物体上叠加三套电磁偏差线圈来为三种空间上的相关信号进行编码。)

图解：一名技术人员正在利用核磁共振成像设备扫描一个病人的头部。今天，高速计算机的开发和超导磁铁的应用使核磁共振成像设备提供具体的解剖结构图像成为可能。功能性核磁共振成像技术也可以让脑部及其它器官功能的变化图形化。这些功能使核磁共振成像设备成为一种在现代医学中前途无量的检测仪器。(美国放射医学学院)

在大西洋另一端的英国，英格兰诺丁汉大学的Peter Mansfield也有着类似的想法。1972年，他的研究逐渐深入到使用核磁共振获得水晶物质在结构上的细节的领域。在1973年公布的研究结果中，Mansfield和他的伙伴也使用了磁场偏差的方案。在1976年，Mansfield开发出一种快速扫描核磁共振成象技术，即回波平面成像技术。这种技术在几微秒内便可扫描整个大脑。回波平面核磁共振成像技术对于在中风诊断中使用的快速核磁共振成像技术和用于脑部研究的功能性核磁共振成像技术都是至关重要的。在1972年发表时，Lauterbur的研究成果包括了一张测试样品：对浸在水瓶中的试管的图像。在使用小型核磁共振扫描仪(他同时还使用了从CT扫描中借鉴的被称为后部发射的技术)得到了上述成果后，他继续对小的物体——包括她女儿从他家附近的长岛抓到的一只小螃蟹进行成像的努力。到1974年，他已经可以使用大型核磁共振成像设备对活老鼠的胸腔进行成像了。Mansfield在1975年时也可以对一些植物的茎以及一只死火鸡的腿进行成像。第二年，他拍摄下了第一个人类的核磁共振成像照片——一个人的手指部的成像，包括检测到的骨头、骨髓、神经以及血管。Damadian与此同时也致力于成像技术的研究。1977年，他成功地对一个男性的胸腔进行了成像。 到二十世纪八十年代初期，核磁共振成像技术领域的迅速发展让这种技术进入商业领域成为可能。(由于容易让人产生不愉快的联想，“核”这个词被悄悄地从核磁共振技术的术语中去掉了。)高速计算机及超导磁铁的出现让研究人员能制造出在敏感性和分辨率方面有了极大提高的更大的核磁共振设备。

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